Javascript is momenteel uitgeschakeld in uw browser. Verschillende functies van deze site werken niet als javascript is uitgeschakeld.

open toegang tot wetenschappelijk en medisch onderzoek

Van indiening tot eerste redactionele beslissing.

Van redactionele acceptatie tot publicatie.

Bovenstaand percentage manuscripten is in de afgelopen 12 maanden afgewezen.

Open access peer-reviewed wetenschappelijke en medische tijdschriften.

Dove Medical Press is lid van de OAI.

Bulk herdrukken voor de farmaceutische industrie.

We bieden onze auteurs echte voordelen, waaronder een snelle verwerking van papers.

Registreer uw specifieke gegevens en specifieke geneesmiddelen die u interesseren en we zullen de informatie die u verstrekt koppelen aan artikelen uit onze uitgebreide database en pdf-kopieën onmiddellijk naar u e-mailen.

Terug naar Tijdschriften » International Journal of Nanomedicine » Volume 14

Amfifiele nanogels: invloed van oppervlaktehydrofobiciteit op eiwitcorona, biocompatibiliteit en cellulaire opname

Auteurs Bewersdorff T, Gruber A, Eravci M, Dumbani M, Klinger D, Haase A 

Gepubliceerd 26 september 2019 Jaargang 2019:14 Pagina's 7861—7878

DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S215935

Beoordeling door enkele anonieme peer review

Redacteur die publicatie heeft goedgekeurd: Dr. Thomas Webster

Tony Bewersdorff,1 Alexandra Gruber,2 Murat Eravci,1 Malti Dumbani,1 Daniel Klinger,2 Andrea Haase1 1Duits Federaal Instituut voor Risicobeoordeling (BfR), Afdeling Chemische en Productveiligheid, Berlijn, Duitsland; 2Freie Universität Berlin, Instituut voor Farmacie (Farmaceutische Chemie), Berlijn, Duitsland Correspondentie: Andrea Haase Duits Federaal Instituut voor Risicobeoordeling, Afdeling Chemische en Productveiligheid, Max-Dohrn-Strasse 8-10, Berlijn 10589, Duitsland Tel +49 30 184 122 7600 Email [email protected] Daniel Klinger Freie Universität Berlin, Institute of Pharmacy (Farmaceutical Chemistry), Königin-Luise Street 2-4, Berlin 14195, Germany Tel +49 308 386 0001 Email [email protected] Achtergrond en doel: Nanogels (NG's) zijn veelbelovende hulpmiddelen voor het afleveren van geneesmiddelen, maar zijn doorgaans beperkt tot hydrofiele geneesmiddelen. Veel potentiële nieuwe medicijnen zijn hydrofoob. Onze studie onderzoekt systematisch amfifiele NG's met variërende hydrofobiciteit, maar vergelijkbare colloïdale kenmerken om vergelijkbaarheid te garanderen. De amfifiele NG's die in dit experiment worden gebruikt, bestaan ​​uit een hydrofiel polymeernetwerk met willekeurig verdeelde hydrofobe groepen. Voor de synthese gebruikten we een nieuwe synthetische platformbenadering. Hun amfifiele karakter maakt de inkapseling van hydrofobe geneesmiddelen mogelijk. Belangrijk is dat de hydrofiele/hydrofobe balans de medicijnbelading en biologische interacties bepaalt. Met name eiwitadsorptie aan NG-oppervlakken is afhankelijk van hydrofobiciteit en bepaalt kritisch de circulatietijd. Onze studie onderzoekt hoe netwerkhydrofobiciteit de eiwitbinding, biocompatibiliteit en cellulaire opname beïnvloedt. Methoden: De biologische compatibiliteit van de NG's werd onderzocht met een WST-1-assay in monocytachtige THP-1-cellen. De corona-vorming van serumeiwitten werd onderzocht met behulp van dynamische lichtverstrooiing en tweedimensionale gelelektroforese. Eiwitten werden geïdentificeerd door vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie. Bovendien werd de cellulaire opname geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Resultaten: Alle NG's waren zeer biocompatibel. De eiwitbindingspatronen voor de twee meest hydrofobe NG's leken erg op elkaar, maar verschilden duidelijk van de hydrofiele. Over het algemeen nam de eiwitbinding toe met toenemende hydrofobiciteit, wat resulteerde in een verhoogde cellulaire opname. Conclusie: Onze studie ondersteunt het vaststellen van structuur-eigenschap relaties en draagt ​​bij aan de nauwkeurige balans tussen maximale laadcapaciteit met lage eiwitbinding, optimale biologische halfwaardetijd en goede biocompatibiliteit. Dit is een belangrijke stap om ontwerpprincipes van amfifiele NG's af te leiden die kunnen worden toegepast als vehikels voor medicijnafgifte. Trefwoorden: instelbare amfifiele nanogels, afstembare hydrofiele/hydrofobe balans, biocompatibiliteit, cellulaire opname, eiwitcorona, THP-1-cellen

Nanogels (NG's) als verknoopte polymere nanodeeltjes (NP's) zijn in opkomst als flexibele, veelzijdige dragers van geneesmiddelen1 die interessant zijn voor vele toepassingen, variërend van kankertherapie tot nanoantibiotica.2–8 Conventionele NG's vertonen echter één groot nadeel: hun algehele hydrofiliciteit hun toepassing voor hydrofobe geneesmiddelen drastisch beperkt.

Amfifiele NG's, gebaseerd op een hydrofiele polymeermatrix, zijn onlangs naar voren gekomen als nieuwe dragers voor hydrofobe geneesmiddelen.9-11 Nauwkeurige afstemming van de leveringseigenschappen kan worden bereikt door de hydrofiele/hydrofobe balans van het netwerk te veranderen. In het algemeen maakt toenemende hydrofobiciteit hogere laadcapaciteiten en meer aanhoudende afgifteprofielen mogelijk,12 maar kan leiden tot verschillende ongewenste effecten zoals verminderde systemische circulatietijd en verminderde biocompatibiliteit.13,14 In bloed adsorberen plasma-eiwitten selectief aan NG-oppervlakken, waardoor een specifieke eiwit corona. De identiteit en hoeveelheid gebonden eiwitten worden voornamelijk bepaald door oppervlaktekenmerken, waarbij hydrofobiciteit en oppervlaktelading de belangrijkste zijn.13-19 De corona vertegenwoordigt de eigenlijke bio-nano-interface, bemiddelt cellulaire interacties en geeft de biologische identiteit van een NP weer. 20,21 Hydrofobe oppervlakken bevorderen de binding van opsoninen, specifieke plasma-eiwitten, die NP's labelen voor opname en verwijdering door het reticulo-endotheliale systeem (RES).22,23,24 Dientengevolge wordt de bloedcirculatietijd drastisch verminderd, waardoor het therapeutisch potentieel van de NP's wordt beperkt .25 Hydrofiele oppervlaktedelen daarentegen beschermen NP's tegen opsonisatie en voorkomen cellulaire opname door de RES, beschreven als "stealth-effect".26-29

Amfifiele NG's combineren aspecten van hydrofobe en hydrofiele oppervlakken in één enkel colloïdaal systeem. Hun eiwitinteracties en biocompatibiliteit worden dus veel minder begrepen. Het wordt duidelijk dat structurele optimalisatie voor medicijnafgiftetoepassingen een zorgvuldige afweging vereist, aangezien toenemende hydrofobiciteit leidt tot verhoogde laadcapaciteiten van hydrofobe ladingen, maar aan de andere kant ook resulteert in een verminderde halfwaardetijd en biocompatibiliteit. Om specifieke hydrofiele/hydrofobe netwerksamenstellingen te correleren met laad-/afgifteprofielen en met NG-gedrag in biologische systemen, is systematisch onderzoek nodig.

Tot nu toe zijn dergelijke systematische studies echter zeer uitdagend, aangezien conventionele synthetische benaderingen om amfifiele NG's te genereren ook de colloïdale kenmerken veranderen, zoals grootte, grootteverdeling en morfologie. De eiwitcorona is ook afhankelijk van de grootte, kromming en vorm van NP.30-32 Bijgevolg zou het onmogelijk zijn om te onderscheiden of een ander NG-gedrag het gevolg is van veranderde grootte of gewijzigde amfifiliciteit.

Er is dus een nieuwe synthetische benadering nodig. We hebben onlangs een synthetische platformbenadering ontwikkeld op basis van de functionalisering van reactieve precursordeeltjes met hydrofiele en hydrofobe delen,12,33 die het mogelijk maakt om amfifiliciteit af te stemmen en tegelijkertijd een meerderheid van vergelijkbare colloïdale kenmerken te bieden. Daarom hebben we nu toegang tot een bibliotheek van vergelijkbare NG's met variërende netwerksamenstelling maar vergelijkbare colloïdale eigenschappen. Alle NG's zijn gebaseerd op een amfifiel netwerk van poly(methacrylamide)copolymeren met 80 mol% hydrofiele 2-hydroxypropylamine (HPA)-groepen maar 20 mol% verschillende hydrofobe amiden, dwz benzyl-, hexyl-, cholesteryl- en dodecylgroepen waarnaar wordt verwezen as BENZA-20, HEXA-20, CHOLA-20 en DODA-20.

Dit stelt ons voor het eerst in staat om systematisch de invloed van netwerksamenstelling op de interactie met biologische systemen te onderzoeken. Menselijke monocyt-achtige THP-1-cellen worden gebruikt als een modelsysteem voor menselijke monocyten, die een hoofdbestanddeel van het RES zijn. We onderzoeken biocompatibiliteit en cellulaire opname in THP-1-cellen. Eiwitbinding werd geanalyseerd door tweedimensionale gelelektroforese (2DE) en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) gecombineerd met de Top 3-benadering voor kwantificering.34,35 Voor zover ons bekend is dit de eerste systematisch onderzoek naar zeer vergelijkbare amfifiele NG's met verschillende hydrofobiciteiten, hun specifieke eiwitcorona's en de resulterende effecten in termen van cellulaire opname en biocompatibiliteit. In combinatie met onze eerder bepaalde laadcapaciteiten en vrijgaveprofielen12 zijn deze resultaten belangrijk om structuur-eigenschap- en structuur-activiteitsrelaties vast te stellen.

Alle reagentia werden gekocht bij commerciële bronnen en gebruikt zonder verdere zuivering, tenzij anders vermeld. Watervrije oplosmiddelen werden verkregen uit een MB-SPS-800 (MBraun, Duitsland) oplosmiddelzuiveringssysteem en ultrapuur water (MQ) uit een LaboStar Pro UV 2 (Evoqua, Duitsland) watersysteem. Pentafluorfenylmethacrylaat (PFPMA),36,37 poly(pentafluorfenylmethacrylaat) (PPFPMA),38 CHOLA39,40 en [2-(aminoethyl)-carbamothioyl]-5-aminofluoresceïne (FITCA)41 en post-modificatie van PPFPMA12,42 werden bereid volgens de literatuurprocedures. Vocht- of luchtgevoelige reacties werden uitgevoerd in droog glaswerk onder stikstofatmosfeer. Dialyse werd uitgevoerd in dialysebuizen van gebenzoyleerde cellulose (breedte: 32 mm, grenswaarde voor molecuulgewicht 2000 g/mol, Sigma-Aldrich, Duitsland).

Amfifiele NG's werden gesynthetiseerd zoals recentelijk beschreven.12 Eerst werden reactieve PPFPMA-precursordeeltjes gesynthetiseerd via mini-emulsiepolymerisatie. Kort samengevat werd een oliefase bestaande uit 10 g PFPMA, 0,4 g ethyleenglycoldimethacrylaat (EGDMA, 5 mol-% gew. PFPMA), hexadecaan (0,44 g) en 195 mg 2,2′-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN) gedispergeerd in een waterige fase van natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedeïoniseerd (DI) water (1,25 mg/ml, in 200 ml DI-water, 2,5 gew.% tov PFPMA) door pre-sonicatie in een sonicatiebad (Elmasonic P30 H, Elma, Duitsland) gedurende 10 minuten. Volledige dispersie werd bereikt door ultrasone trillingen met een Digital Sonifier SFX 550 (Branson, Duitsland). De emulsie werd 10 minuten met stikstof gespoeld voordat men de reactie 24 uur bij 70°C liet verlopen. Deeltjesdispersies werden gezuiverd via herhaalde stappen van centrifugeren, wassen en opnieuw dispergeren en gevriesdroogd voor opslag.

Post-modificatie van reactieve voorloperdeeltjes werd uitgevoerd op gedispergeerde PPFPMA-deeltjes (400 mg, 1,59 mmol tov monomeereenheden van PPFPMA-deeltjes, 1,0 eq) in dimethylformamide (DMF) door toevoeging van verschillende molaire verhoudingen van met amine gefunctionaliseerde delen (3,0 eq tov monomeereenheden ) en triethylamine (TEA) (660 µL, 4,77 mmol, 3,0 eq tov monomeereenheden), zoals samengevat in Tabel S1.

Men liet de reactie 24 uur bij 50°C verlopen. Daarna werden de deeltjes gezuiverd door uitgebreide dialyse, eerst tegen DMF (1 week) en vervolgens tegen DI-water (1 week) en MQ (1 week). De deeltjes werden vervolgens gevriesdroogd voor opslag bij gebruik. In deze studie werden de volgende vijf NG's gebruikt: poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) (PHPMA) als hydrofiele controle, zonder hydrofobe groepen en varianten die elk 80 mol% hydrofiel HPA en 20 mol% van een andere hydrofobe groep, namelijk benzylamine (BENZA-20), hexylamine (HEXA-20), een amine-gefunctionaliseerde cholesterylgroep (CHOLA-20) en dodecylamine (DODA-20). Geschatte verschillen in NG-hydrofobiciteiten werden berekend met behulp van http://www.molinspiration.com, wat resulteerde in de theoretische logaritmische partitiecoëfficiënten (logP).

De synthese van de met fluorescentie gelabelde NG's werd uitgevoerd analoog aan de post-modificatie van de niet-gelabelde NG's, maar in een benadering in twee stappen. In het kort werden gevriesdroogde PPFPMA-deeltjes (2,00 g, 7,93 mmol tov monomeereenheden van PPFPMA-deeltjes, 1,0 eq) gedispergeerd in 400 ml DMF door korte behandeling in een ultrasoonapparaat (Elmasonic P30 H, Elma). De deeltjes werden gedurende de nacht in DMF opgezwollen voordat met amine gefunctionaliseerd fluoresceïne (FITCA) (71 mg, 0,16 mmol, 0,02 eq. tor. monomeereenheden) en TEA (3,3 ml, 23,8 mmol, 3 eq. tor. monomeereenheden) werden toegevoegd en tot 50°C verwarmd. . Na 24 uur liet men 30 ml van de dispersie (150 mg PPFPMA-FITC-deeltjes) nog eens 24 uur reageren met verschillende verhoudingen van met amine gefunctionaliseerde eenheden (3,0 eq. tov monomeereenheden), zoals samengevat in Tabel S2.

Daarna werden de NG's gezuiverd door uitgebreide dialyse tegen DMF en vervolgens tegen DI-water en MQ. De NG's werden vervolgens gevriesdroogd en verkregen als lichtgeel poeder. Ze kunnen worden opgeslagen en opnieuw gedispergeerd in DI-water of PBS door middel van een vortex- en korte behandeling met ultrasoonapparaat. Karakterisering van de NG's via dynamische lichtverstrooiing (DLS)-meting na herdispersie in DI-water wordt weergegeven in Tabel 1. Tabel 1 Karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen van de NG's

Tabel 1 Karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen van de NG's

NG's werden gedispergeerd in MQ of PBS door vortexen, gevolgd door 30 minuten sonicatie bij kamertemperatuur (RT).

Het succes van de post-modificatiereactie werd gevolgd door verzwakte totale reflectie-Fourier-transform infraroodspectroscopie (ATR-FTIR-spectroscopie) op gevriesdroogde deeltjes zoals eerder beschreven.12 De grootte van de NG's na post-modificatie werd bepaald door DLS met behulp van een nicomp nano Z3000 (Particle Sizing Systems, VS) met een vaste verstrooiingshoek van 173°. De metingen zijn uitgevoerd bij RT. Om het zeta-potentieel te meten, werden NG's gemeten bij 200 g/ml in MQ of PBS bij 25°C met behulp van Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Duitsland). Er werd een pre-equilibratietijd van 2 minuten gebruikt, verzwakker en spanning werden automatisch geselecteerd en er werden drie runs van 30 metingen gebruikt.

De grootte van de NG's in droge toestand werd onderzocht via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Monsters werden bereid door een druppel van 10 L van de NG-dispersie (1 mg / ml in MQ) op een met koolstof gecoat koperen rooster (400 mesh, Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbicau, Duitsland) gedurende 45 s aan te brengen. Het supernatant werd verwijderd met filtreerpapier. Dit proces werd 10 keer herhaald en men liet de roosters een nacht aan de lucht drogen. De TEM-monsters werden daarna gemeten met behulp van de TEM-modus van een Hitachi Scanning Electron Microscope (SU8030, Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan) met een werkspanning van 30,0 kV bij verschillende vergrotingen. Om de grootte en de grootteverdeling van de NG's in gedroogde toestand te evalueren, werd de diameter van 500 NG's van elk monster bepaald met de software ImageJ (versie 1.52e).

Polymeerfilms werden geproduceerd via spincoating van polymeeroplossingen op glasplaatjes (Ø 25 mm, Neolab, Duitsland) met een spinprocessor WS-659MZ-23NPPB (Laurell Technologies Corporation, VS). Polymeeroplossingen (1,5 gew.% in CHCl3 met een paar druppels MeOH, indien nodig) werden op de objecten gedruppeld en gedurende 40 s met 11.000 toeren per minuut (rpm) gecoat. Polymeerfilms werden onder vacuüm gedroogd (RT, 90 min). Statische contacthoekmetingen werden uitgevoerd met behulp van de sessiele-druppelmethode op een contacthoeksysteem OCA 20 (DataPhysics Instruments, Duitsland) en verwerkt met SCA20 (versie 3.12.11, DataPhysics Instruments). Er werd twee microliter MQ op het substraat gedruppeld en men liet deze in evenwicht komen (20 s, RT). De contacthoeken van 18 metingen van drie coatingmonsters werden bepaald en gemiddeld.

De menselijke monocytachtige cellijn THP-1 werd verkregen van DSMZ (Duitse verzameling van micro-organismen en celculturen, Duitsland) en gekweekt in RPMI 1640 compleet celkweekmedium (CCM) dat 10% FBS, 2 mM L-Glutamine, 100 mM 4 bevat. -(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES), 100 eenheden/ml penicilline, 0,1 mg/ml streptomycine in een incubator (37°C, 5% CO2). Celkweekmedium, FBS en additieven werden verkregen van PAN Biotech, Duitsland. Cellen werden geteld met behulp van een Casy TTC (Roche Diagnostics GmbH, Duitsland).

Cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes (TPP, Duitsland) bij 15.000 cellen/100 L CCM, 24 uur geïncubeerd (37°C, 5% CO2), behandeld met NG's (eindconcentraties 20, 75 en 100 µg/ml) en geïncubeerd voor nog eens 24 cellen werden tweemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd WST-1-oplossing (4-[3-(4-joodfenyl)-2-(4-nitrofenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzeendisulfonaat, Roche, Zwitserland) toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant en nog 2 uur geïncubeerd (37°C, 5% C02). Absorptie werd gemeten met behulp van een GENios-plaatlezer bij 450 nm (TECAN, Zwitserland).

De NG's werden gedispergeerd met 300 µg/ml in 5 ml CCM (met 10% FBS-goud) in steriele glazen flesjes die een magnetische roerstaaf bevatten door te roeren (700 rpm, 30 minuten, RT). NG's werden bovenop 4,5 ml 1,5 M sucrose geladen (behalve PHPMA, die op 1,25 M sucrose was geladen) en gepelleteerd via ultracentrifugatie (17.900 g, 2,5 uur bij kamertemperatuur). CCM zonder NG's diende als controle en werd op dezelfde manier behandeld. Pellets werden tweemaal gewassen met PBS (17.900 g, 30 minuten bij kamertemperatuur). Monsters werden verdeeld in twee gelijke delen, één voor tweedimensionale polyacrylamidegelelektroforese (2D-PAGE) analyse en één voor LC-MS/MS-analyse.

Tenzij anders vermeld, werden chemicaliën gekocht bij Carl Roth GmbH (Duitsland). Eiwitten werden geëlueerd in 500 µL 2D-lysisbuffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 4% chaps, 2% farmaceutisch pH 4-7, 1% dithiothreitol (DTT) en proteaseremmers). Het totale eiwitgehalte werd gemeten met behulp van de 2D Quant-kit (GE Healthcare, Duitsland). Voor de iso-elektrische focusseringsmonsters (500 µL) werden geladen op niet-lineaire IPG-strips (24 cm ImmobilineTM DrySrip pH 4–7 (NL), GE Healthcare) en gedurende 1 uur geëquilibreerd in equilibratiebuffer EB1 (360 mg/ml ureum, 24 mg/ml SDS en 50,4 mM/ml Tris HCl, pH 8,6). Actieve rehydratatie en focussering werden uitgevoerd (15 uur bij 30 V, 1,5 uur bij 200 V, 1 uur bij 500 V, 13,5 uur gradiënt 500-1000 V, 3 uur gradiënt 1000-8000 V en 6 uur bij 8000 V) met de GE Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare). Daarna werden eiwitten gereduceerd (1% DTT in EB1, 15 minuten) en vervolgens gealkyleerd (4% joodacetamide in EB1, 15 minuten). Strepen werden overgebracht op 12,5% SDS-polyacrylamidegels. Elektroforese werd uitgevoerd met de GE Ettan DALTtwelve System Separation Unit (GE Healthcare). Gels werden gefixeerd (30% ethanol, 10% azijnzuur in water) en gekleurd met ruthenium II tris (bathofenanthroline disulfaat) chelaat (0,4 µM RU-II en 20% ET in MQ).43 Gels werden gescand met een VersaDoc 4000MP beeldvormingssysteem (Bio-Rad, Duitsland) met behulp van excitatie λ=473 nm/detectie λ=610 nm en geanalyseerd met Delta2D versie 4.6 (Decodon, Duitsland). Elk monster werd geanalyseerd in drie onafhankelijke replica's.

Tenzij anders vermeld, werden chemicaliën gekocht bij Carl Roth GmbH. NG-pellets werden gereconstitueerd in 50 µL denaturatiebuffer (6 M ureum/2 M thioureum in 10 mM HEPES, pH 8,0), gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur verminderd met 1 µL 0,5 M DTT in 50 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) en gealkyleerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker door toevoeging van 1 µL van 0,5 M joodacetamide in ABC. Vervolgens werd 2 L Trypsine/Lys-C Mix (Promega, VS) bij 0,5 g/µL in ABC toegevoegd en gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. De ureumconcentratie werd verlaagd tot <2 M door toevoeging van 150 µL ABC voor digestie met trypsine gedurende de nacht bij kamertemperatuur. De digestie werd gestopt door aanzuren met 200 µl 5% acetonitril (ACN), 3% trifluorazijnzuur (TFA). Tryptische peptiden werden ontzout met stadiumtips

Tenzij anders vermeld, zijn alle apparaten gekocht bij Thermo Scientific (VS) en zijn alle chemicaliën gekocht bij Carl Roth GmbH. Ontzoute peptiden werden gereconstitueerd in 20 L 0,1% (v/v) TFA, 5% (v/v) ACN en 4 µL werden geanalyseerd met een reversed-phase capillair nano-vloeistofchromatografiesysteem (Ultimate 3000), verbonden met een Orbitrap Velos massaspectrometer via een nanospray. Het LC-systeem was een flexiebron uitgerust met een roestvrijstalen emitter. Monsters werden geïnjecteerd en geconcentreerd op een valkolom (PepMap100 C18, 3 m, 100, 75 m id x 2 cm), geëquilibreerd met 0,05% TFA, 2% ACN in water. Na het inline schakelen van de valkolom, werden LC-scheidingen uitgevoerd op een capillaire kolom (Acclaim PepMap100 C18, 2 m, 100 Å, 75 m id × 25 cm) bij een stroomsnelheid van het eluens van 300 nL / min met behulp van een lineaire gradiënt van 3- 50% B in 50 minuten. Mobiele fase A bevatte 0,1% mierenzuur (FA) in water en mobiele fase B bevatte 0,1% FA in ACN. Massaspectra werden verkregen in een gegevensafhankelijke modus met behulp van een enkele MS-onderzoeksscan met een resolutie van 60.000 in de Orbitrap, en MS/MS-scans van de 20 meest intense voorloperionen in de lineaire trap-quadrupool. Het MS-onderzoeksbereik was m/z 350-1500. De dynamische uitsluitingstijd (voor precursorionen) was ingesteld op 60 s en automatische versterkingsregeling was ingesteld op 1 × 106 en 5.000 voor respectievelijk Orbitrap-MS- en LTQ-MS / MS-scans.

MS- en MS/MS-gegevens van elke LC/MS-run werden geanalyseerd met behulp van de MaxQuant-software (versie 1.6.0.16). Identificatie van eiwitten werd uitgevoerd met behulp van de MaxQuant-geïmplementeerde Andromeda-peptide-zoekmachine tegen een referentie-proteoomdatabase van Bos taurus (Bovine / Uniprot-proteoom-ID: UP000009136, versie 1 oktober 2017). De aanvankelijke maximale afwijkingen van de voorloper- en fragmentmassa werden ingesteld op respectievelijk 7 ppm en 0,5 Da. Variabele modificatie (methionine oxidatie en N-terminale acetylering) en vaste modificatie (cysteïne carbamidomethylering) werden ingesteld voor het zoeken en trypsine met maximaal twee gemiste splitsingen werden gekozen voor het zoeken. De minimale peptidelengte was ingesteld op 7 aminozuren en het percentage valse ontdekkingen voor peptide- en eiwitidentificatie was ingesteld op 0,01. Relatieve eiwitovervloed werd bepaald met behulp van de Top 3-benadering. Top 3-intensiteiten van de geïdentificeerde eiwitten werden berekend door de intensiteiten van de drie meest intense unieke peptiden voor elk eiwit op te tellen.34,35 Tabel S3 vat de kwantificering van NG-eiwitcorona's samen.

Gegevens voor fysisch-chemische karakterisering van de FITC-gelabelde NG's zijn opgenomen in tabel S4. NG's werden gesoniceerd in een Sonorex RK510-waterbad (30 minuten, RT). Vervolgens werd 40 µg/ml van de voorgeïncubeerde NG's (2 uur, RT, CCM met 10% FBS) 2 uur geïncubeerd met THP-1-cellen (37°C, 5% CO2). Na drie keer wassen met PBS (500 g, 5 minuten), werd de opname geanalyseerd met behulp van een FACS Aria III (BD Biosciences, Duitsland), uitgerust met een blauwe laser (488 nm), een fluorescentiedetector (582/42 nm) en een 70 µm mondstuk. Een voorbeeld van de differentiatiepanelen die we tijdens de flowcytometrie hebben gebruikt, wordt gegeven in figuur S1.

Om de invloed van NG-hydrofobiciteit op eiwitinteractie, biocompatibiliteit en cellulaire opname te onderzoeken, werd een bibliotheek van amfifiele NG's (Figuur 1) met variërende hydrofobiciteiten maar vergelijkbare colloïdale eigenschappen gesynthetiseerd. Hiervoor gebruikten we onze recent ontwikkelde synthetische platformbenadering die is gebaseerd op de functionalisering van reactieve precursordeeltjes met hydrofiele en hydrofobe delen (Figuur 1A).12 Goed gedefinieerde reactieve precursordeeltjes met een smalle grootteverdeling werden verkregen uit mini-emulsiepolymerisatie curve is te vinden in figuur S2). De colloïdale kenmerken van deze precursordeeltjes, dwz de verknopingsdichtheid, grootte en grootteverdeling, worden vervolgens gelijkelijk vertaald in de verschillende amfifiele NG's. Tabel 1 geeft een samenvatting van de deeltjesgrootte en de respectieve standaarddeviatie, als maat voor de dispersiteit van de deeltjesgrootte (DLS-curven zijn opgenomen in figuur S2). Om de gelijkenis in colloïdale kenmerken tussen precursordeeltjes en de amfifiele NG's verder aan te tonen, werden TEM-afbeeldingen van PPFPMA en NG's vergeleken (TEM-afbeeldingen en statistische evaluaties van PPFPMA-precursoren en CHOLA-20 NG's als representatieve monsters voor de amfifiele NG's zijn opgenomen in figuur S3 ). Door deze benadering (Figuur 1A) te volgen, hebben we nu toegang tot een bibliotheek van vergelijkbare NG's met verschillende netwerksamenstelling, waaronder een hydrofiele NG (PHPMA) en vier verschillende amfifiele NG's (Figuur 1B) met elk 80 mol% hydrofiele HPA in combinatie met 20 mol% van een specifieke hydrofobe groep, dwz benzylamine (BENZA-20), hexylamine (HEXA-20), een amine-gefunctionaliseerd cholesteryl (CHOLA-20) of dodecylamine (DODA-20). Nadat we een gelijke molaire opname van de specifieke hydrofobe groepen hadden aangetoond (elk 20 mol%), hebben we de hydrofobiciteit van de verschillende NG's beoordeeld. Eerst werden de logaritmische partitiecoëfficiënten (logP) van de resulterende hydrofiele/hydrofobe herhalende eenheden van methacrylamide op het netwerkcopolymeer berekend, waardoor een eerste classificatie van de vijf NG's in drie groepen mogelijk was: 1) hydrofiel, 2) matig hydrofoob en 3) hydrofoob ( Figuur 1B). De hydrofiele groep bevat alleen PHPMA (logP = 1,52) terwijl BENZA-20 (logP = 3,18) en HEXA-20 (logP = 4,23) werden toegewezen aan de matig hydrofobe NG's. DODA-20 (logP = 7,26) en CHOLA-20 (logP = 8,86) vertegenwoordigen de hydrofobe NG's. Figuur 1 Een reactieve precursordeeltjesbenadering geeft toegang tot een NG-bibliotheek met variërende hydrofobiciteit en vergelijkbare colloïdale kenmerken. Opmerkingen: Schematische synthese van de NG's is afgebeeld (A) op basis van voorloperdeeltjes die vervolgens met amine worden gefunctionaliseerd (B). We gebruikten HPA dat zich vertaalt naar PHPMA en vier gemodificeerde varianten die elk 80 mol% HPA en 20 mol% van een andere hydrofobe groep bevatten, namelijk hexylamine (HEXA-20), benzylamine (BENZA-20), lineaire dodecylamine (DODA- 20) evenals een met amine gefunctionaliseerde cholesterylgroep (CHOLA-20). Afkortingen: NG, nanogel; NG's, nanogels; HPA, 2-hydroxypropylamine; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide); FITCA, met amine gefunctionaliseerd fluoresceïne; EGDMA, ethyleenglycoldimethacrylaat.

Figuur 1 Een reactieve precursordeeltjesbenadering geeft toegang tot een NG-bibliotheek met variërende hydrofobiciteit en vergelijkbare colloïdale kenmerken. Opmerkingen: Schematische synthese van de NG's is afgebeeld (A) op basis van voorloperdeeltjes die vervolgens met amine worden gefunctionaliseerd (B). We gebruikten HPA dat zich vertaalt naar PHPMA en vier gemodificeerde varianten die elk 80 mol% HPA en 20 mol% van een andere hydrofobe groep bevatten, namelijk hexylamine (HEXA-20), benzylamine (BENZA-20), lineaire dodecylamine (DODA- 20) evenals een met amine gefunctionaliseerde cholesterylgroep (CHOLA-20). Afkortingen: NG, nanogel; NG's, nanogels; HPA, 2-hydroxypropylamine; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide); FITCA, met amine gefunctionaliseerd fluoresceïne; EGDMA, ethyleenglycoldimethacrylaat.

Om deze theoretische waarden te versterken, werd de hydrofobiciteit van elke NG onderzocht door middel van statische contacthoekmetingen met behulp van de sessiele-druppelmethode. Omdat contacthoekmetingen op drie NP-films echter misleidend kunnen zijn vanwege capillaire krachten bij interparticulaire holtes, werden de metingen uitgevoerd op lineaire polymeeranalogen, waarmee de hierboven beschreven classificatie werd bevestigd (Figuur 2). De hydrofiele PHPMA (Figuur 2A) heeft een contacthoek van θ 23 ± 2 °. BENZA-20 (Figuur 2B) en HEXA-20 (Figuur 2C) van de matige hydrofobe groep vertoonden respectievelijk θ 70±3° en θ 76±1°. De grootste contacthoeken werden gevonden voor de leden van de hydrofobe groep, dwz CHOLA-20 (Figuur 2D) en DODA-20 (Figuur 2E) met θ 80±1° en θ 92±1°. Figuur 2 Meting van de contacthoek maakt de categorisering van de NG's mogelijk. Opmerkingen: We kunnen drie groepen onderscheiden: met PHPMA (A) als hydrofiel, BENZA-20 (B) en HEXA-20 (C) als matig hydrofoob en CHOLA-20 (D) en DODA-20 (E) als hydrofoob. Afkortingen: NG's, nanogels; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Figuur 2 Meting van de contacthoek maakt de categorisering van de NG's mogelijk. Opmerkingen: We kunnen drie groepen onderscheiden: met PHPMA (A) als hydrofiel, BENZA-20 (B) en HEXA-20 (C) als matig hydrofoob en CHOLA-20 (D) en DODA-20 (E) als hydrofoob. Afkortingen: NG's, nanogels; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Daarnaast zijn eerder laad- en losexperimenten met Nijlrood als hydrofobe modellading uitgevoerd om de invloed van de polymeersamenstelling op de hydrofobiciteit van het interne netwerk te bepalen.12 De incorporatie van 20 mol% hydrofobe groepen verhoogde de laadcapaciteit in de volgorde: BENZA-20<HEXA-20<DODA-20<CHOLA-20. De laadcapaciteit van CHOLA-20 was verdrievoudigd in vergelijking met PHPMA, terwijl de overeenkomstige afgiftesnelheid significant werd verlaagd.12 Deze resultaten versterken niet alleen de classificatie op basis van hydrofobiciteit, maar demonstreren ook het hoge potentieel van de amfifiele NG's als nanodragers voor hydrofobe verbindingen. Om het therapeutisch potentieel te evalueren, moeten echter de interacties van de NG's met biologische systemen worden bepaald.

Toenemende hydrodynamische diameters van de NG's na incubatie in fysiologisch medium, zoals beoordeeld via vergelijkende DLS-metingen, wijzen al op de vorming van eiwitcorona's. Tabel 1 vat de toename van de grootte samen als verschillen van de hydrodynamische diameters in CCM en MQ (Δdh), die ook grafisch wordt weergegeven in figuur 3. De toename van de grootte komt grotendeels overeen met gerapporteerde veranderingen als gevolg van eiwitcorona-vorming.46 Bovendien is de zeta-potentiaal in MQ en PBS werd bepaald (Tabel 1). Neutrale tot licht negatieve waarden in MQ en PBS suggereren dat de colloïdale stabiliteit van de NG's voornamelijk kan worden toegeschreven aan neutrale PHPMA-segmenten op het deeltjesoppervlak. Figuur 3 Illustratie van grootteverschillen (Δdh) tussen incubatie van NG's in MQ en CCM. Opmerkingen: NG's werden gedispergeerd in MQ en CCM door vortexen, gevolgd door 30 minuten sonicatie bij kamertemperatuur. DLS werd na 2 uur uitgevoerd. Afkortingen: NG's, nanogels; MQ, ultrazuiver water; CCM, compleet celkweekmedium (RPMI 1640 met 10% FBS); kamertemperatuur, kamertemperatuur; DLS, dynamische lichtverstrooiing; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Figuur 3 Illustratie van grootteverschillen (Δdh) tussen incubatie van NG's in MQ en CCM. Opmerkingen: NG's werden gedispergeerd in MQ en CCM door vortexen, gevolgd door 30 minuten sonicatie bij kamertemperatuur. DLS werd na 2 uur uitgevoerd. Afkortingen: NG's, nanogels; MQ, ultrazuiver water; CCM, compleet celkweekmedium (RPMI 1640 met 10% FBS); kamertemperatuur, kamertemperatuur; DLS, dynamische lichtverstrooiing; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Van PHPMA, het hoofdbestanddeel (80 mol%) van de amfifiele NG's, is bekend dat het biocompatibel is.42,47 De amfifiele netwerken bevatten echter ook nog eens 20 mol% hydrofobe groepen, wat de interactie van de NG's met lipidemembranen en veroorzaken enige toxiciteit. Eerder hebben we al aangetoond dat amfifiele NG's met variërende amfifiliciteit geen cytotoxisch effect vertoonden op normale menselijke keratinocyten, wat wijst op een goede biocompatibiliteit.12 Geredeneerd door het feit dat monocyten een hoofdbestanddeel van de RES zijn, hebben we de biocompatibiliteit in de monocytachtige menselijke cel beoordeeld. lijn THP-1 (Figuur 4). Alle NG's bleken biocompatibel te zijn, wat in overeenstemming is met onze vorige studie. Figuur 4 Levensvatbaarheid van monocytachtige THP-1-cellen toont een goede biocompatibiliteit van de NG's met verschillende netwerkhydrofobiciteiten. Opmerkingen: Afgebeeld zijn gemiddelde waarden van drie biologische herhalingen en standaardfout van gemiddelde (SEM). Afkorting: NG's, nanogels.

Figuur 4 Levensvatbaarheid van monocytachtige THP-1-cellen toont een goede biocompatibiliteit van de NG's met verschillende netwerkhydrofobiciteiten. Opmerkingen: Afgebeeld zijn gemiddelde waarden van drie biologische herhalingen en standaardfout van gemiddelde (SEM). Afkorting: NG's, nanogels.

Om de eiwitcorona die wordt gesuggereerd door de waargenomen groottetoename door DLS-metingen in CCM verder te onderzoeken, werd de eiwitbinding van alle NG's onderzocht met behulp van 2DE. De resulterende 2D-gelbeelden verkregen na 30 minuten incubatie in CCM onthulden significante kwalitatieve en kwantitatieve verschillen tussen de corona's van alle NG's. Elke NG vertoonde een uniek en individueel vlekkenpatroon (Figuur 5, Figuren S4A-E), waarbij ook de hoeveelheid en intensiteit van vlekken aanzienlijk varieerde. Terwijl de hydrofiele NG PHPMA het laagste aantal eiwitvlekken vertoonde, werden aanzienlijk verhoogde aantallen vlekken waargenomen met toenemende hydrofobiciteit. Daarom was de eiwitbinding veel minder prominent voor PHPMA (Figuur 5A) in vergelijking met alle andere NG's. In het bijzonder, in vergelijking met de matige hydrofobe NG BENZA-20 (Figuur 5B) en de hydrofobe DODA-20 (Figuur 5C), ondersteunt de waargenomen toename in aantal vlekken en intensiteit de aanname van een verhoogde eiwitbinding met verhoogde hydrofobiciteit. De spotpatronen van alle NG's werden geanalyseerd en vergeleken met PHPMA en dienden als benchmark. Alle eiwitvlekken met significant verhoogde intensiteit in vergelijking met PHPMA (dwz intensiteit verhoogd >1,5, p<0,05, n=3) werden in aanmerking genomen. De grootste verschillen werden gevonden voor een van de meest hydrofobe NG's, namelijk DODA-20, waar in totaal 49 significant verhoogde eiwitvlekken in vergelijking met PHPMA werden gedetecteerd (Figuur 5D). Wat betreft het aantal spots dat verschilt van PHPMA, kunnen de NG's als volgt worden gerangschikt: DODA-20>CHOLA-20=BENZA-20>HEXA-20. Figuur 5 Verschillen in de eiwitcorona's worden geïllustreerd met behulp van de spotpatronen van de verkregen 2DE-analyse van representatieve NG's. Opmerkingen: NG's (300 µg/mL) werden gedurende 30 minuten in CCM geïncubeerd. Gebonden eiwitten werden geëlueerd en geanalyseerd met behulp van 2DE-analyse. Afgebeeld zijn de resulterende representatieve 2D-gels voor (A) PHPMA, (B) BENZA-20 en (C) DODA-20. Alle andere 2D-afbeeldingen zijn afgebeeld in figuur S4. In vergelijking met blanco controle (geen NG's), geven labels significant gewijzigde eiwitten aan binnen de respectieve NG's. Overeenkomsten en verschillen met betrekking tot het aantal significante vlekken (dwz intensiteit verhoogd >1,5, p<0,05, n=3) in elke corona ten opzichte van PHPMA als benchmark worden gevisualiseerd in een Venn-diagram (D). Afkortingen: 2DE, tweedimensionale gelelektroforese; NG's, nanogels; CCM, compleet celkweekmedium (RPMI 1640 met 10% FBS); PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Figuur 5 Verschillen in de eiwitcorona's worden geïllustreerd met behulp van de spotpatronen van de verkregen 2DE-analyse van representatieve NG's. Opmerkingen: NG's (300 µg/mL) werden gedurende 30 minuten in CCM geïncubeerd. Gebonden eiwitten werden geëlueerd en geanalyseerd met behulp van 2DE-analyse. Afgebeeld zijn de resulterende representatieve 2D-gels voor (A) PHPMA, (B) BENZA-20 en (C) DODA-20. Alle andere 2D-afbeeldingen zijn afgebeeld in figuur S4. In vergelijking met blanco controle (geen NG's), geven labels significant gewijzigde eiwitten aan binnen de respectieve NG's. Overeenkomsten en verschillen met betrekking tot het aantal significante vlekken (dwz intensiteit verhoogd >1,5, p<0,05, n=3) in elke corona ten opzichte van PHPMA als benchmark worden gevisualiseerd in een Venn-diagram (D). Afkortingen: 2DE, tweedimensionale gelelektroforese; NG's, nanogels; CCM, compleet celkweekmedium (RPMI 1640 met 10% FBS); PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Eiwitbindingspatronen tussen de twee hydrofobe NG's vertoonden een hoge mate van overeenkomst, dwz DODA-20 en CHOLA-20 hadden 16 eiwitvlekken gemeen. Terwijl DODA-20 slechts 11 en 6 plekken gemeen had met respectievelijk de matige hydrofobe NG's BENZA-20 en HEXA-20. Overeenkomsten en verschillen in de eiwitcorona's worden gevisualiseerd in een Venn-diagram op basis van de spotnummers (Figuur 5D). Het wordt duidelijk dat het aantal significante vlekken ongeveer dezelfde trend volgt als de NG-hydrofobiciteit. Bij het vergelijken van de twee NG's binnen de respectieve groep (dwz matig hydrofoob en hydrofoob), is het opmerkelijk dat de iets minder hydrofobe NG in de respectieve cluster elk een hoger aantal uitgesproken vlekken heeft. Dit suggereert dat de vorming en samenstelling van de eiwitcorona niet alleen afhankelijk is van de algehele hydrofobiciteit, maar ook kan afhangen van de moleculaire structuur van de hydrofobe groepen.

Nadat kwalitatieve verschillen in de eiwitcorona waren aangetoond, werden kwantitatieve onderzoeken naar eiwitbinding uitgevoerd met behulp van LC-MS / MS met behulp van de Top 3-benadering (tabel S3). Nogmaals, DODA-20 vertoonde de hoogste eiwitbinding, terwijl alle andere NG's vergelijkbare eiwitbinding vertoonden (Figuur 6). Interessant is dat totaal gebonden eiwit niet noodzakelijk overeenkomt met het totale aantal verschillende eiwitten dat in elke corona is geïdentificeerd. Dit kan gebeuren wanneer een enkel eiwit in grotere hoeveelheden aan een NG bindt, terwijl verschillende eiwitten in kleinere hoeveelheden aan een ander NG binden. Het hoogste aantal verschillende individuele eiwitten werd bijvoorbeeld gevonden in HEXA-20 (Tabel 2) waar 111 verschillende eiwitten konden worden geïdentificeerd, terwijl iets minder eiwitten (105) konden worden geïdentificeerd op DODA-20, ondanks de veel hogere hoeveelheid totale gebonden eiwitten. Tabel 2 Overzicht van het aantal corona-eiwitten geïdentificeerd via LC-MS/MS vergeleken met de hydrofiele NG PHPMA Figuur 6 Vergelijking van de hoeveelheid gebonden eiwitten in de corona van de respectieve NG's met behulp van de Top 3-benadering. Opmerkingen: Eiwitten in de NG-corona's werden geïdentificeerd met behulp van LC-MS/MS en de overvloed werd bepaald met behulp van de Top 3-benadering. De intensiteit voor elk eiwit wordt verkregen door de intensiteiten van de drie meest intense unieke peptiden voor dat eiwit op te tellen. Op basis daarvan werden de totale eiwitintensiteiten voor elke NG bepaald. Afkortingen: NG's, nanogels; LC-MS/MS, vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; AU, arbitrage-eenheid; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Tabel 2 Overzicht van het aantal corona-eiwitten geïdentificeerd via LC-MS/MS vergeleken met het hydrofiele NG PHPMA

Figuur 6 Vergelijking van de hoeveelheid gebonden eiwitten in de corona van de respectievelijke NG's met behulp van de Top 3-benadering. Opmerkingen: Eiwitten in de NG-corona's werden geïdentificeerd met behulp van LC-MS/MS en de overvloed werd bepaald met behulp van de Top 3-benadering. De intensiteit voor elk eiwit wordt verkregen door de intensiteiten van de drie meest intense unieke peptiden voor dat eiwit op te tellen. Op basis daarvan werden de totale eiwitintensiteiten voor elke NG bepaald. Afkortingen: NG's, nanogels; LC-MS/MS, vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; AU, arbitrage-eenheid; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Om deze context nauwkeuriger aan te pakken, was de volgende stap om de specifieke samenstelling van de eiwitcorona's van de NG's met elkaar te vergelijken. Figuur 7 toont de samenvatting van de 15 meest voorkomende eiwitten in alle NG's, die ten minste 78% van de totale corona's uitmaken. Omdat onze NG's alleen verschillen in hydrofobiciteit, terwijl colloïdale eigenschappen grotendeels vergelijkbaar zijn, kunnen we de invloed van hydrofobiciteit op de eiwitcoronasamenstelling direct waarnemen. Door een uniform kleurenschema toe te passen, kunnen verschillen in de corona-samenstelling eenvoudig worden gevisualiseerd. Het spreekt voor zich dat de NG's verschillende invloeden hebben op de corona-composities. We wilden ook onderzoeken of onze groepen (matig hydrofoob en hydrofoob) vergelijkbaar zijn wat betreft hun eiwitcorona. Daarom werden de verkregen eiwitintensiteiten van de Top 3-benadering gebruikt. We vergeleken de samenstelling van de verschillende eiwitcorona's van elke NG ten opzichte van PHPMA. Als resultaat kon een classificatie van het respectievelijke eiwit in de groep, verhoogd of verlaagd vergeleken met PHPMA, worden gemaakt. De resultaten van de NG's met BENZA-20 en HEXA-20 als vertegenwoordigers van de matige hydrofobe en CHOLA-20 en DODA-20 als leden van de hydrofobe groep werden vervolgens vergeleken. De visualisatie wordt weergegeven als clusteranalyse (Figuur 8) en toont duidelijk de verhoogde (rode) en verlaagde (groene) eiwitten van de respectieve corona in vergelijking met PHPMA. De eiwitcorona's van DODA-20 en CHOLA-20 lijken erg op elkaar en zijn duidelijk te onderscheiden van de corona's van BENZA-20 en HEXA-20. Dit is te zien aan het zeer gelijkaardige kleurenpatroon. De meeste eiwitten (elk één doos) vertonen hetzelfde gedrag met betrekking tot verhoogde of verlaagde intensiteit in vergelijking met PHPMA binnen de hydrofobe groep. De hydrofobiciteit van de afzonderlijke NG's lijkt dus een belangrijke factor te zijn voor de samenstelling van de eiwitcorona. Figuur 7 Impact van de verschillende NG's op de relatieve verdeling van de meest voorkomende eiwitten over alle eiwitcorona's. Opmerkingen: Afgebeeld zijn de 15 meest voorkomende eiwitten van elke afzonderlijke eiwitcorona (algemeen samengevat), die werden geïdentificeerd via LC-MS/MS en relatieve percentages werden berekend met behulp van de Top 3-benadering. Resultaten voor elk eiwit worden gegeven in percentage van de totale gebonden eiwitten in die corona. Resterende eiwitten (restpercentage tot 100) zijn niet afgebeeld. Afkortingen: NG's, nanogels; LC-MS/MS, vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide). Figuur 8 Clusteranalyse voor vergelijking van de NG-corona-eiwitten toont de groepering van de NG's met betrekking tot gelijkenis binnen de eiwit-corona. Opmerkingen: Overeenkomsten en verschillen in de eiwitcorona's van de NG's worden gevisualiseerd met behulp van een HCA. Elk eiwit (elke rechthoek staat voor een ander geïdentificeerd eiwit) wordt vergeleken met PHPMA, dat dient als een benchmarkdeeltje (waarden worden genormaliseerd) en waarden worden omgezet in een heatmap. Rood toont een hogere intensiteit en groen een lagere intensiteit in vergelijking met PHPMA. Afkortingen: NG's, nanogels; HCA, hiërarchische clusteranalyse; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Figuur 7 Impact van de verschillende NG's op de relatieve verdeling van de meest voorkomende eiwitten over alle eiwitcorona's. Opmerkingen: Afgebeeld zijn de 15 meest voorkomende eiwitten van elke afzonderlijke eiwitcorona (algemeen samengevat), die werden geïdentificeerd via LC-MS/MS en relatieve percentages werden berekend met behulp van de Top 3-benadering. Resultaten voor elk eiwit worden gegeven in percentage van de totale gebonden eiwitten in die corona. Resterende eiwitten (restpercentage tot 100) zijn niet afgebeeld. Afkortingen: NG's, nanogels; LC-MS/MS, vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Figuur 8 Clusteranalyse voor vergelijking van de NG-corona-eiwitten toont de groepering van de NG's met betrekking tot gelijkenis binnen de eiwitcorona. Opmerkingen: Overeenkomsten en verschillen in de eiwitcorona's van de NG's worden gevisualiseerd met behulp van een HCA. Elk eiwit (elke rechthoek staat voor een ander geïdentificeerd eiwit) wordt vergeleken met PHPMA, dat als benchmarkdeeltje dient (waarden worden genormaliseerd) en waarden worden omgezet in een heatmap. Rood toont een hogere intensiteit en groen een lagere intensiteit in vergelijking met PHPMA. Afkortingen: NG's, nanogels; HCA, hiërarchische clusteranalyse; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Vervolgens konden we een aantal verschillende eiwitten detecteren die significant waren verminderd (factor <0,5) of verhoogd (factor>1,5) met betrekking tot hun intensiteit in vergelijking met PHPMA (tabel 2). Eiwitintensiteiten werden genormaliseerd met PHPMA als referentie, log (2) getransformeerd en de Z-score werd berekend. Profielen van gewijzigde eiwitten werden vervolgens vergeleken tussen de twee groepen amfifiele NG's (matige hydrofobe groep versus hydrofobe groep). We vonden eiwitten die zich hetzelfde gedroegen, bijv. vrij laag in intensiteit op de matige hydrofobe NG's (BENZA-20 en HEXA-20) en toenamen op de hydrofobe (CHOLA-20 en DODA-20) of vice versa (Figuur 9A en B, Tabel 3). Eiwitten zoals pentraxine, complementfactor I en complementfactor B (Figuur 9C-E) bonden bijvoorbeeld sterker aan de meer hydrofobe NG's (DODA-20 en CHOLA-20). Apolipoproteïne E en serumalbumine daarentegen werden in veel lagere hoeveelheden gevonden (Figuur 9F en G). We kunnen dus concluderen dat de hydrofobiciteit van de NG's de hoeveelheid en de identiteit van eiwitten in de corona aanzienlijk beïnvloedde. Tabel 3 Vergelijkende beoordeling van eiwitcorona's Figuur 9 De vergelijking, met betrekking tot hun intensiteit, van genormaliseerde expressieprofielen van de geïdentificeerde corona-eiwitten ondersteunt de groepering van de onderzochte NG's. Opmerkingen: Eiwitintensiteiten werden genormaliseerd (PHPMA als referentie), log (2) getransformeerd en de Z-score werd berekend met behulp van Perseus versie 1.6.1.3. De expressieprofielen werden vervolgens onderzocht op overeenkomsten. Met toenemende hydrofobiciteit vertonen corona-eiwitten van de twee groepen NG's, namelijk matig hydrofoob (BENZA-20+HEXA-20) en hydrofoob (DODA-20+CHOLA-20), ofwel een toename (A) of een afname (B) in hun expressieprofielen. Pentraxine (C), complementfactor I (D) en complementfactor B (E) worden afgebeeld als voorbeelden voor eiwitten met een verhoogde intensiteit onder de hydrofobe NG's in vergelijking met de matig hydrofobe NG's. Apolipoproteïne E (F) en serumalbumine (G) vertonen daarentegen een verminderde intensiteit bij de hydrofobe NG's in vergelijking met de matige NG's. Afkortingen: NG's, nanogels; AU, arbitrage-eenheid; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Tabel 3 Vergelijkende beoordeling van eiwitcorona's

Figuur 9 De vergelijking, met betrekking tot hun intensiteit, van genormaliseerde expressieprofielen van de geïdentificeerde corona-eiwitten ondersteunt de groepering van de onderzochte NG's. Opmerkingen: Eiwitintensiteiten werden genormaliseerd (PHPMA als referentie), log (2) getransformeerd en de Z-score werd berekend met behulp van Perseus versie 1.6.1.3. De expressieprofielen werden vervolgens onderzocht op overeenkomsten. Met toenemende hydrofobiciteit vertonen corona-eiwitten van de twee groepen NG's, namelijk matig hydrofoob (BENZA-20+HEXA-20) en hydrofoob (DODA-20+CHOLA-20), ofwel een toename (A) of een afname (B) in hun expressieprofielen. Pentraxine (C), complementfactor I (D) en complementfactor B (E) worden afgebeeld als voorbeelden voor eiwitten met een verhoogde intensiteit onder de hydrofobe NG's in vergelijking met de matig hydrofobe NG's. Apolipoproteïne E (F) en serumalbumine (G) vertonen daarentegen een verminderde intensiteit bij de hydrofobe NG's in vergelijking met de matige NG's. Afkortingen: NG's, nanogels; AU, arbitrage-eenheid; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Ten slotte hebben we onderzocht hoe veranderingen in eiwitbinding worden weerspiegeld door een veranderde cellulaire opname in THP-1-cellen. Hiervoor gebruikten we analoge amfifiele NG's maar met covalent bevestigd FITC als fluorescerend label, wat gemakkelijke kwantificering mogelijk maakte met behulp van flowcytometrie op basis van een recentelijk vastgestelde methodologie.48 De respectieve NG's worden aangeduid als PHPMA-FITC, BENZA-20-FITC, HEXA- 20-FITC, DODA-20-FITC en CHOLA-20-FITC. De fysisch-chemische karakterisering van de FITC-gelabelde NG's is samengevat in Tabel 4. NG's werden voorgeïncubeerd gedurende 2 uur in CCM zodat zich een eiwitcorona kan vormen en werden vervolgens gedurende 2 uur geïncubeerd met THP-1-cellen. Figuur 10 toont duidelijke variaties in de cellulaire opname waarbij PHPMA-FITC het minst wordt opgenomen, terwijl de meer hydrofobe NG's, dwz CHOLA-20-FITC, een verhoogde opname lieten zien. Alle vier NG's waren significant (p<0,0005) verhoogd in opname in vergelijking met de controle NG PHPMA-FITC. Verder werd waargenomen dat de opname van het hydrofobe NG CHOLA-20-FITC in THP-1-cellen in vergelijking met beide matige hydrofobe NG's (BENZA-20-FITC en HEXA-20-FITC) ook significant verhoogd is (p<0.0005) . Voor de tweede vertegenwoordiger van de hydrofobe groep, DODA-20-FITC, was dit alleen het geval in vergelijking met BENZA-20-FITC (p<0,0005). Deze resultaten correleren goed met de verhoogde hoeveelheid eiwitadsorptie en tonen aan dat toenemende hydrofobiciteit leidde tot een toename van cellulaire opname in THP-1-cellen, wat de correlatie tussen eiwitcorona en cellulaire opname benadrukt. Figuur 10 Flowcytometriegegevens onthullen een correlatie tussen de opname van NG's in menselijke monocytachtige THP-1-cellen en de hydrofobiciteit van NG's. Opmerkingen: NG's werden gedurende 2 uur voorgeïncubeerd met CCM met 10% FBS. Na 2 uur incubatie met THP-1-cellen in een incubator (37°C, 5% CO2) werd de opname gemeten met behulp van flowcytometrie. Gemiddelde fluorescentiewaarden inclusief SEM (n=3 biologische herhalingen) als balken met significantie (*P<0,0005) worden weergegeven. Alle vier NG's waren significant (p<0,0005) verhoogd in opname versus de controle PHPMA (niet afgebeeld). Afkortingen: NG's, nanogels; CCM, compleet celkweekmedium (RPMI 1640 met 10% FBS); SEM, standaardfout van gemiddelde; AU, arbitrage-eenheid; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Figuur 10 Flowcytometriegegevens onthullen een correlatie tussen de opname van NG's in menselijke monocytachtige THP-1-cellen en de hydrofobiciteit van NG's. Opmerkingen: NG's werden gedurende 2 uur voorgeïncubeerd met CCM met 10% FBS. Na 2 uur incubatie met THP-1-cellen in een incubator (37°C, 5% CO2) werd de opname gemeten met behulp van flowcytometrie. Gemiddelde fluorescentiewaarden inclusief SEM (n=3 biologische herhalingen) als balken met significantie (*P<0,0005) worden weergegeven. Alle vier NG's waren significant (p<0,0005) verhoogd in opname versus de controle PHPMA (niet afgebeeld). Afkortingen: NG's, nanogels; CCM, compleet celkweekmedium (RPMI 1640 met 10% FBS); SEM, standaardfout van gemiddelde; AU, arbitrage-eenheid; PHPMA, poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide).

Hier hebben we eiwitbinding, biocompatibiliteit en cellulaire opname van amfifiele NG's onderzocht. Deze nieuwe familie van NG's is gebaseerd op een verknoopt amfifiel copolymeernetwerk dat oplosbaarheid van hydrofobe geneesmiddelen in het binnenste mogelijk maakt. Zoals eerder is aangetoond, kan de hydrofobiciteit van het netwerk worden aangepast om laad- en vrijgaveprofielen nauwkeurig aan te passen12, wat het grote potentieel van deze nieuwe dragers voor medische toepassingen aantoont. Het nauwkeurig bepalen van hun therapeutisch potentieel vereist echter een meer gedetailleerd onderzoek van de interacties van de NG's met biologische systemen. Vooral de corona van geadsorbeerd eiwit is van belang omdat dit verband houdt met een snelle bloedklaring en het therapeutisch potentieel van de NG's beperkt.

We hebben een bibliotheek samengesteld van goed gedefinieerde amfifiele NG's met variërende hydrofobiciteit (Figuur 1) maar vergelijkbare colloïdale kenmerken, dwz verknopingsdichtheid, grootte, grootteverdeling, waardoor echte vergelijkbaarheid tussen verschillende NG's mogelijk wordt. Hoewel polydispersiteit een rol kan spelen bij de interactie van deeltjes met biologische systemen, maakt ons concept het mogelijk om dit effect te verminderen tot een systematische invloed waarvan wordt aangenomen dat deze in gelijke mate bijdraagt ​​aan alle monsters. Zoals te zien is in tabel 1, kunnen slechts kleine afwijkingen in deeltjesgroottes en grootteverdelingen van NG's worden waargenomen, die binnen de foutenmarge voor DLS liggen. Alleen de hydrofiele PHPMA NG is groter dan de hydrofoob gemodificeerde. Er wordt gesuggereerd dat dit voortkomt uit een hogere netwerkhydratatie, wat resulteert in een grotere mate van zwelling. De monocytachtige menselijke cellijn THP-1 werd gekozen als celmodel, aangezien monocyten een hoofdbestanddeel van het RES zijn dat verantwoordelijk is voor snelle opname en klaring. In eerste instantie werd biocompatibiliteit beoordeeld omdat amfifiliciteit een risicofactor kan zijn vanwege ongunstige interacties met lipidemembranen.49,50,51 Alle NG's waren zeer biocompatibel (Figuur 4), wat in overeenstemming is met onze eerdere experimenten met normale menselijke keratinocyten.12 De verhoogde levensvatbaarheid van de cellen tot meer dan 100% kan worden toegeschreven aan verschillende factoren. Het kan ook wijzen op een algemene mogelijke invloed van NP's op colorimetrische tests52 of ook op het mitochondriale reductasesysteem. Deze experimenten versterken echter onze veronderstelling dat de zeer hydrofiele aard van PHPMA als de belangrijkste netwerkcomponent zich vertaalt naar de amfifiele NG's en zorgt voor een goede biocompatibiliteit.

Vervolgens hebben we ons gericht op de bepaling van eiwitbinding in fysiologische vloeistoffen, aangezien de resulterende eiwitcorona de biologische identiteit van de NG's in vivo bepaalt.53,54 Eiwitadsorptie wordt grotendeels bepaald door oppervlaktelading en hydrofobiciteit.17,55 Onze studie bevestigde dat overeenkomsten in eiwitbindingsprofielen waren goed gecorreleerd met de geschatte hydrofobiciteit van de NG's. De toename van hydrodynamische diameters (tabel 1 en figuur 3) duidt op verschillen in corona-vorming met variërende NG-hydrofobiciteit. Terwijl de echt hydrofiele PHPMA NG slechts een marginale toename in grootte laat zien, vertonen de meer hydrofobe NG's significant grotere maten, wat wijst op verhoogde eiwitadsorptie. Deze bevindingen komen zeer goed overeen met de resultaten van 2DE (Figuur 5, Figuren S4A-E), wat een significant verhoogd aantal en intensiteit van vlekken bevestigt voor de matige hydrofobe NG BENZA-20 en de hydrofobe NG DODA-20 in vergelijking met PHPMA. Vergelijkbare resultaten werden verkregen door LC-MS/MS-onderzoeken (Figuur 6), die een toename van eiwitadsorptie voor de hydrofobe NG DODA-20 aantoonden. Hoewel vergelijkbare trends zijn waargenomen voor andere NP-systemen,17,18 onthulde onze studie dat voor NG's met vergelijkbare hydrofobiciteit maar verschillende functionele hydrofobe delen (dwz BENZA-20 versus HEXA-20 en DODA-20 versus CHOLA-20) de toename in eiwitadsorptie varieerde aanzienlijk. Dit wordt vooral duidelijk door DODA-20 en CHOLA-20 te vergelijken. Hoewel beide hydrofobe herhalende eenheden in het netwerk vergelijkbare logP-waarden (7,3 en 8,9) vertonen, was de toename in grootte voor DODA-20 dubbel (Δs=100 nm) vergeleken met CHOLA-20 (Δs=50 nm) en intensiteit van totaal gebonden eiwitten was bijna vier keer hoger voor DODA-20 in vergelijking met CHOLA-20 (Figuur 6). De eiwitbinding lijkt dus niet alleen te worden bepaald door de algehele hydrofobiciteit, maar wordt ook beïnvloed door de moleculaire structuur.

We hebben ook de kwantitatieve samenstelling van de eiwitcorona's onderzocht, die typisch uniek is voor verschillende deeltjes.56 Er wordt echter aangenomen dat specifieke eiwitbindingsprofielen ook overeenkomsten vertonen die tot vergelijkbare biologische gevolgen kunnen leiden. Het is van groot belang om specifieke deeltjeskenmerken te identificeren die het optreden van bepaalde eiwitcorona-gemeenschappelijkheden bepalen, wat op zijn beurt zal helpen om een ​​goed gedefinieerde biologische respons te bepalen. Hier hebben we ons gericht op de invloed van de samenstelling van het NG-netwerk (en de bijbehorende hydrofobiciteit van het oppervlak) op het proces van opsonisatie, dat verantwoordelijk is voor de verwijdering van de deeltjes door opname in cellen van de RES. Dit wordt gemedieerd door binding van specifieke eiwitten, opsoninen genaamd. Hoewel er ook opsonines zijn die hemolyse en trombogeniciteit veroorzaken, leidt adsorptie van opsonines die tot het complementsysteem behoren tot een snelle klaring van NP's uit de systemische bloedcyclus via complementreceptor-gemedieerde fagocytose.57

Daarom hebben we ons gericht op het correleren van netwerkhydrofobiciteit met adsorptie van dit soort opsoninen. Tot nu toe was deze taak zeer uitdagend omdat het variëren van de hydrofobiciteit van het netwerk ook resulteerde in veranderingen in de colloïdale kenmerken die ook veranderingen in eiwitadsorptieprofielen kunnen veroorzaken. Onze synthetische platformbenadering, die goed gedefinieerde NG's genereert met vergelijkbare colloïdale kenmerken, biedt een unieke kans om de invloed van netwerksamenstelling van eiwitbinding systematisch te bestuderen.

Interessant genoeg vonden we een grotere overlap tussen de hydrofobe NG's. Van de eiwitvlekken die significant in intensiteit waren verhoogd (2DE, figuur 5D) in vergelijking met PHPMA (factor> 1,5), hebben de hydrofobe NG's CHOLA-20 en DODA-20 in totaal 16 vlekken gemeen. Als we de groep van de matig hydrofobe NG's (BENZA-20 en HEXA-20) beschouwen, vinden we slechts zes eiwitvlekken gemeenschappelijk. Overeenkomsten tussen vergelijkbare structuren (Figuur 1B) zijn smaller. We vinden slechts zes gemeenschappelijke eiwitvlekken in HEXA-20 en DODA-20 (lineaire delen) en negen in BENZA-20 en CHOLA-20 (niet-lineaire delen). Dit suggereert dat de NG-hydrofobiciteit een grotere invloed heeft op de coronasamenstelling dan bijvoorbeeld de structuur. Deze relatie is ook duidelijk in de clusteranalyse van de eiwitcorona (Figuur 8), die een grotere overeenkomst bevestigt tussen de hydrofobiciteiten van de NG's dan tussen vergelijkbare structuren, waardoor de indruk van de 2D-gels wordt versterkt.

Voor een beter begrip hebben we de 15 meest voorkomende eiwitten voor elke corona nader bekeken (Figuur 7). We identificeerden eiwitten met verschillende adsorptiekenmerken in de groep van de matige hydrofobe NG's (BENZA-20 en HEXA-20) in vergelijking met de hydrofobe groep (CHOLA-20 en DODA-20). Om de visualisatie te verbeteren, hebben we de expressieprofielen van de intensiteiten van de eiwitten genormaliseerd naar het referentiedeeltje PHPMA (Figuur 9). De toename (Figuur 9A) of afname (Figuur 9B) van eiwitadsorptie met toenemende hydrofobiciteit is nu duidelijk zichtbaar. Interessant genoeg vonden we een verrijking van complementactiveringscomponenten zoals pentraxine (Figuur 9C), complementfactor I (Figuur 9D) en B (Figuur 9E) voor de meest hydrofobe NG's, dwz CHOLA-20 en DODA-20. Ter vergelijking: de matige hydrofobe NG's BENZA-20 en HEXA-20 vertonen een lagere binding van deze complementactiveringsfactoren. Pentraxinen zijn plasma-eiwitten met een pentamere structuur die dienen als herkenningsmoleculen voor vreemde stoffen (bijv. antigenen) en ze labelen voor activering van het aangeboren immuunsysteem. Ze interageren ook met de klassieke cascade van het complementsysteem door binding van complementcomponent 1q (C1q) en Fc-receptoren om immuunresponsen te activeren.58 Met complementfactoren I en B werden twee andere interessante kandidaten gevonden in de corona van de hydrofobe NG's . Complementfactor I speelt een rol bij de regulatie van de complementcascade, terwijl complementfactor B betrokken is bij de activering van de alternatieve route van complementactivering.59,60 Deze opsonine-coronacomponenten zouden de bloedretentietijd en daarmee de biologische halfwaardetijd drastisch kunnen verminderen. leven, waardoor medische toepassing wordt belemmerd.

Aangezien CHOLA-20 en DODA-20 NG's verschillende componenten van dit complementsysteem in hun eiwitcorona's bevatten, verwachten we dat deze NG's veel sneller zullen worden geklaard in vergelijking met de matige hydrofobe NG's BENZA-20, HEXA-20 en de hydrofiele PHPMA NG. Deze verwachting wordt inderdaad ondersteund door onze celopname-experimenten. We konden duidelijk aantonen dat toenemende hydrofobiciteit en de resulterende specifieke adsorptie van opsoninen leidt tot een verhoogde cellulaire opname in menselijke monocyt-achtige THP-1-cellen (Figuur 10). Dit komt overeen met andere rapporten, die aantonen dat een verhoogde hydrofobiciteit in het algemeen vaak leidt tot een veel snellere opname van NP's.13,17,24 In onze studie konden we aantonen dat de eiwitadsorptie ook cruciaal afhangt van de moleculaire structuur van de respectieve functionele hydrofobe groepen. Zoals aangetoond voor CHOLA-20 en DODA-20 NG's met vergelijkbare hydrofobiciteit (logP rond 7-8), varieerde de hoeveelheid eiwitadsorptie aanzienlijk. De samenstelling van de eiwitcorona's vertoonde echter overeenkomsten, wat zich vertaalt in een vergelijkbare cellulaire opname. Onze platformbenadering, resulterend in NG's met variërende hydrofiliciteit maar vergelijkbare colloïdale kenmerken, maakte voor de eerste keer de nauwkeurige identificatie van dit verschil in eiwitbindingspatronen op de moleculaire samenstelling van amfifiele NG's mogelijk. Deze resultaten tonen het belang aan van het niet alleen afstemmen van vehikels voor medicijnafgifte met betrekking tot één aspect (bijv. hoge laadcapaciteiten), maar eerder om ze in hun geheel te onderzoeken om rekening te houden met tegengestelde effecten. Voor de hier gebruikte amfifiele NG's betekent dit dat de hydrofiele/hydrofobe balans nauwkeurig moet worden aangepast om een ​​hoge medicijnbelading en gewenste afgiftekinetiek mogelijk te maken, terwijl een optimale biologische halfwaardetijd wordt geboden.

In deze studie werden amfifiele NG's met instelbare hydrofobiciteit maar vergelijkbare colloïdale kenmerken gebruikt om systematisch de invloed van netwerksamenstelling en hydrofobiciteit op de interacties met biologische systemen te onderzoeken. We onderzochten niet alleen biocompatibiliteit en eiwitbinding, maar ook cellulaire opname van de NG's in menselijke monocytachtige THP-1-cellen. Er kon worden aangetoond dat toenemende hydrofobiciteit van het netwerk de interacties met eiwitten verhoogt. Zo vertoonde DODA-20, als een van de meest hydrofobe representatieve NG's die in deze studie werden gebruikt, een veel hogere eiwitintensiteit in LC-MS/MS in vergelijking met PHPMA, de meest hydrofiele NG's. Opvallend was dat ook werd waargenomen dat voor DODA-20 en CHOLA-20 NG's met vergelijkbare hydrofobiciteit, significante verschillen in de hoeveelheid geadsorbeerde eiwitten konden worden gedetecteerd. Dit suggereert een sterke bijkomende invloed van de moleculaire structuur van de hydrofobe groepen op de eiwitbinding. Dit werd ook bevestigd met 2DE-gels.

Naast deze kwalitatieve onderzoeken toonden kwantitatieve studies aan dat de samenstelling van de eiwitcorona ook varieerde in afhankelijkheid van de hydrofobiciteit. Specifiek werd een hogere hoeveelheid opsoninen bepaald voor de eiwitcorona's van de hydrofobe NG's CHOLA-20 en DODA-20 in vergelijking met de gematigde NG's BENZA-20 en HEXA-20 en de hydrofiele NG PHPMA. Deze bevindingen correleerden goed met de verhoogde opname van deze NG's in THP-1-cellen. Zo beïnvloedden hydrofobiciteit en moleculaire structuur van de respectieve hydrofobe groepen niet alleen de eiwitbinding (zowel kwalitatief als kwantitatief), maar ook de interacties van de NG's met cellen van de RES. Daarom maken deze resultaten, samen met ons recente onderzoek naar het laden en vrijkomen van een hydrofobe modelverbinding, het ontwerp mogelijk van optimale geneesmiddeldragersystemen voor hydrofobe geneesmiddelen. Hiervoor moet de netwerkamfifiliciteit van de nanocarrier in evenwicht worden gebracht met betrekking tot maximale laadcapaciteit aan de ene kant en lage eiwitbinding aan de andere kant, wat resulteert in een verhoogde biologische halfwaardetijd. Als voorbeeld vertegenwoordigen de matige hydrofobe BENZA-20 NG's een compromis tussen de verbeterde laadcapaciteit in vergelijking met PHPMA NG's en matige cellulaire opname in monocytische THP-1-cellen. Om de voordelen van CHOLA-20 NG's, namelijk een hoge laadcapaciteit en kinetiek met langzame afgifte, verder te benutten, moet de eiwitbinding worden verminderd om een ​​verhoogde biologische halfwaardetijd te verkrijgen. In dit opzicht zullen amfifiele NG's met een covalent gebonden PEG-schil worden gesynthetiseerd voor verdere studies.

De auteurs danken hun instellingen voor hun steun aan dit project. Verder willen we de hulp erkennen van de Core Facility BioSupraMol, ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dit werk werd ondersteund door Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR; SFP 1322-502) en door het Collaborative Research Center (CRC) 1112 met financiering voor instrumentatie. We erkennen aanvullende financiële steun voor verbruiksartikelen van Verband der Chemischen Industrie eV (VCI) en Focus Area Nanoscale van de Freie Universität Berlin. A Gruber bedankt vooral de CRC 1112 en Focus area Nanoscale voor beurzen om haar doctoraat te financieren.

De auteurs hebben geen banden of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang. Andrea Haase meldt tijdens de uitvoering van het onderzoek subsidies van het Duitse Federale Instituut voor Risicobeoordeling. De auteurs melden geen andere belangenconflicten in dit werk.

1. Klinger D, Landfester K. Stimuli-responsieve microgels voor het laden en vrijgeven van functionele verbindingen: fundamentele concepten en toepassingen. polymeer. 2012;53(23):5209–5231. doi:10.1016/j.polymeer.2012.08.053

2. Huh AJ, Kwon YJ. "Nanoantibiotica": een nieuw paradigma voor de behandeling van infectieziekten met nanomaterialen in het antibioticaresistente tijdperk. J Bedieningsvrijgave. 2011;156(2):128-145. doi:10.1016/j.jconrel.2011.07.002

3. Kar M, Fechner L, Nagel G, Glitscher E, Noe Rimondino G, Calderón M. Hoofdstuk 12 responsieve nanogels voor antikankertherapie. In: Vashist A, Kaushik AK, Ahmad S, Nair M, redacteuren. Nanogels voor biomedische toepassingen. Londen: de Royal Society of Chemistry; 2018:210-260. doi:10.1039/9781788010481

4. Molina M, Asadian-Birjand M, Balach J, Bergueiro J, Miceli E, Calderón M. Stimuli-responsieve nanogelcomposieten en hun toepassing in nanogeneeskunde. Chem Soc Rev. 2015; 44 (17): 6161-6186.

5. Molina M, Wedepohl S, Miceli E, Calderon M. Geneesmiddelresistentie overwinnen met on-demand geladen thermoresponsieve dendritische nanogels. Nanogeneeskunde (Londen). 2017;12(2):117-129. doi:10.2217/nnm-2016-0308

6. Shatsberg Z, Zhang X, Ofek P, et al. Gefunctionaliseerde nanogels met een antikanker-microRNA voor glioblastoomtherapie. J Bedieningsvrijgave. 2016;239:159-168. doi:10.1016/j.jconrel.2016.08.029

7. Guo B, Zhao J, Wu C, et al. Eenpotssynthese van polypyrrool-nanodeeltjes met instelbare fotothermische conversie en laadcapaciteit van geneesmiddelen. Colloïden Surf B Bio-interfaces. 2019;177:346-355. doi:10.1016/j.colsurfb.2019.02.016

8. Wu C, Zhao J, Hu F, et al. Ontwerp van injecteerbare op agar gebaseerde composiethydrogel voor multi-mode tumortherapie. Koolhydraat Polym. 2018;180:112-121. doi:10.1016/j.carbpol.2017.10.024

9. Schulte B, Rahimi K, Keul H, Demco DE, Walther A, Möller M. Mengen van reactieve prepolymeren om de morfologie en polariteit van op polyglycidol gebaseerde microgels te regelen. Zachte materie. 2015;11(5):943–953. doi:10.1039/c4sm02116a

10. Tiwari R, Heuser T, Weyandt E, Wang B, Walther A. Polyzuurmicrogels met adaptieve hydrofobe pockets en amfolytisch karakter: synthese, oplossingseigenschappen en inzichten in interne nanostructuur door cryogene TEM. Zachte materie. 2015;11(42):8342-8353. doi:10.1039/c5sm01327e

11. Wischke C, Kruger A, Roch T, et al. Endotheelcelrespons op (co)polymeer nanodeeltjes afhankelijk van de inflammatoire omgeving en comonomeerverhouding. Eur J Pharm Biopharm. 2013;84(2):288–296. doi:10.1016/j.ejpb.2013.01.025

12. Gruber A, Işık D, Fontanezi BB, Böttcher C, Schäfer-Korting M, Klinger D. Een veelzijdig synthetisch platform voor amfifiele nanogels met instelbare hydrofobiciteit. Polym Chem. 2018;9(47):5572-5584. doi:10.1039/C8PY01123K

13. Simon J, Wolf T, Klein K, Landfester K, Wurm FR, Mailander V. Hydrofiliciteit regelt de stealth-eigenschappen van met polyfosfoester gecoate nanodragers. Angew Chem Int. Ed Engl. 2018;57(19):5548-5553. doi:10.1002/anie.201800272

14. Aggarwal P, Hall JB, McLeland CB, Dobrovolskaia MA, McNeil SE. Nanodeeltjesinteractie met plasma-eiwitten in verband met de biodistributie van deeltjes, biocompatibiliteit en therapeutische werkzaamheid. Adv Drug Deliv Rev. 2009;61(6):428-437. doi:10.1016/j.addr.2009.03.009

15. Cedervall T, Lynch I, Foy M, et al. Gedetailleerde identificatie van plasma-eiwitten geadsorbeerd op copolymeer-nanodeeltjes. Angew Chem Int. Ed Engl. 2007;46(30):5754-5756. doi:10.1002/anie.200700465

16. Cedervall T, Lynch I, Lindman S, et al. De nanodeeltjes-eiwit corona begrijpen met behulp van methoden om wisselkoersen en affiniteiten van eiwitten voor nanodeeltjes te kwantificeren. Proc Natl Acad Sci VS A. 2007;104(7):2050-2055. doi:10.1073/pnas.0608582104

17. Gessner A, Waicz R, Lieske A, Paulke BR, Mäder K, Müller RH. Nanodeeltjes met afnemende hydrofobiciteiten aan het oppervlak: invloed op de adsorptie van plasma-eiwitten. Int. J. Pharm. 2000;196(2):245-249.

18. Lindman S, Lynch I, Thulin E, Nilsson H, Dawson KA, Linse S. Systematisch onderzoek van de thermodynamica van HSA-adsorptie aan N-iso-propylacrylamide/N-tert-butylacrylamide copolymeer nanodeeltjes. Effecten van deeltjesgrootte en hydrofobiciteit. Nano Let. 2007;7(4):914-920. doi:10.1021/nl062743+

19. Luck M, Paulke BR, Schroder W, Blunk T, Muller RH. Analyse van plasma-eiwitadsorptie op polymere nanodeeltjes met verschillende oppervlaktekenmerken. J Biomed Mater Res. 1998;39(3):478-485.

20. Pearson RM, Juettner VV, Hong S. Biomoleculaire corona op nanodeeltjes: een overzicht van recente literatuur en de implicaties ervan bij gerichte medicijnafgifte. Front Chem. 2014;2:108. doi:10.3389/fchem.2014.00108

21. Strojan K, Leonardi A, Bregar VB, Krizaj I, Svete J, Pavlin M. Dispersie van nanodeeltjes in verschillende media bepaalt in belangrijke mate de samenstelling van hun eiwitcorona. PLOS Een. 2017;12(1):e0169552. doi:10.1371/journal.pone.0169552

22. Jones SW, Roberts RA, Robbins GR, et al. De klaring van nanodeeltjes wordt bepaald door Th1/Th2-immuniteit en stamachtergrond. J Clin Invest. 2013;123(7):3061–3073. doi:10.1172/JCI66895

23. Oh N, Park JH. Endocytose en exocytose van nanodeeltjes in zoogdiercellen. Int J Nanogeneeskunde. 2014;9(Suppl 1):51-63. doi:10.2147/IJN.S26592

24. Owens DE, Peppas NA. Opsonisatie, biodistributie en farmacokinetiek van polymere nanodeeltjes. Int. J. Pharm. 2006;307(1):93–102. doi:10.1016/j.ijpharm.2005.10.010

25. Schottler S, Landfester K, Mailander V. Beheersing van het stealth-effect van nanodragers door de eiwitcorona te begrijpen. Angew Chem Int. Ed Engl. 2016;55(31):8806-8815. doi:10.1002/anie.201602233

26. Allen TM, Hansen CB, de Menezes DEL. Farmacokinetiek van longcirculerende liposomen. Adv Drug Deliv Rev. 1995;16(2):267-284. doi:10.1016/0169-409X(95)00029-7

27. Amoozgar Z, Yeo Y. Recente ontwikkelingen in stealth-coating van medicijnafgiftesystemen voor nanodeeltjes. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2012;4(2):219–233. doi:10.1002/wnan.1157

28. Essa S, Rabanel JM, Hildgen P. Karakterisering van met rhodamine beladen PEG-g-PLA-nanodeeltjes (NP's): effect van poly (ethyleenglycol) entdichtheid. Int. J. Pharm. 2011;411(1–2):178–187. doi:10.1016/j.ijpharm.2011.02.039

29. Reddy KR, Wright TL, Pockros PJ, et al. Werkzaamheid en veiligheid van gepegyleerd (40 kd) interferon alfa-2a vergeleken met interferon alfa-2a bij niet-cirrotische patiënten met chronische hepatitis C. Hepatologie (Baltimore, Md). 2001;33(2):433-438. doi:10.1053/jhep.2001.21747

30. García-Álvarez R, Hadjidemetriou M, Sánchez-Iglesias A, Liz-Marzán LM, Kostarelos K. In vivo vorming van eiwitcorona op gouden nanodeeltjes. Het effect van hun grootte en vorm. nanoschaal. 2018;10(3):1256–1264. doi:10.1039/c7nr08322j

31. Lundqvist M, Augustsson C, Lilja M, et al. Het nanodeeltje eiwit corona gevormd in menselijk bloed of menselijke bloedfracties. PLOS Een. 2017;12(4):e0175871. doi:10.1371/journal.pone.0175871

32. Rahman M, Laurent S, Tawil N, Yahia LH, Mahmoudi M. Nanodeeltjes en eiwitcorona. In: Interacties tussen eiwitten en nanodeeltjes: de bio-nano-interface. Berlijn, Heidelberg: Springer Berlijn Heidelberg; 2013: 21-44.

33. Fleischmann C, Gopez J, Lundberg P, et al. Een robuust platform voor functionele microgels via thiol-een-achemie met reactieve op polyether gebaseerde nanodeeltjes. Polym Chem. 2015;6(11):2029–2037. doi:10.1039/C4PY01766H

34. Silva JC, Denny R, Dorschel C, et al. Gelijktijdige kwalitatieve en kwantitatieve analyse van het Escherichia coli-proteoom: een zoet verhaal. Mol Cell Proteomics. 2006;5(4):589-607. doi:10.1074/mcp.M500321-MCP200

35. Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP, Geromanos SJ. Absolute kwantificering van eiwitten door LCMSE: een deugd van parallelle MS-acquisitie. Mol Cell Proteomics. 2006;5(1):144-156. doi:10.1074/mcp.M500230-MCP200

36. Blazejewski JC, Hofstraat JW, Lequesne C, Wakselman C, Wiersum UE. Vorming van monomere halogeenarylacrylaten in aanwezigheid van gehinderde pyridinebasen. J Fluor Chem. 1998;91(2):175-177. doi:10.1016/S0022-1139(98)00222-X

37. Eberhardt M, Mruk R, Zentel R, Theato P. Synthese van pentafluorfenyl(meth)acrylaatpolymeren: nieuwe voorloperpolymeren voor de synthese van multifunctionele materialen. Europees Polymeer Journal. 2005;41(7):1569–1575. doi:10.1016/j.eurpolymj.2005.01.025

38. Eberhardt M, Théato P. RAFT-polymerisatie van pentafluorfenylmethacrylaat: bereiding van reactieve lineaire diblokcopolymeren. Macromol Rapid Comm. 2005;26(18):1488-1493. doi:10.1002/(ISSN) 1521-3927

39. Kearns MD, Donkor AM, Savva M. Structuur-transfectie-activiteitsstudies van nieuwe kationische op cholesterol gebaseerde amfifielen. Mol Farm. 2008;5(1):128-139. doi:10.1021/mp700131c

40. Nie Y, Gunther M, Gu Z, Wagner E. PEGylering op basis van pyridylhydrazon voor pH-reversibele lipopolyplex-afscherming. Biomaterialen. 2011;32(3):858–869. doi:10.1016/j.biomaterials.2010.09.032

41. Gentsch R, Pippig F, Nilles K, et al. Modulaire benadering van bioactieve vezelnetwerken die oligosachariden dragen. Macromoleculen. 2010;43(22):9239-9247. doi:10.1021/ma101607a

42. Gibson MI, Fröhlich E, Klok HA. Postpolymerisatiemodificatie van poly(pentafluorfenylmethacrylaat): synthese van een diverse in water oplosbare polymeerbibliotheek. J Polym Sci A Polym Chem. 2009;47(17):4332-4345. doi:10.1002/pola.v47:17

43. Rabilloud T, Strub JM, Luche S, Girardet JL, van Dorsselaer A, Lunardi J. Ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate), een krachtige fluorescerende kleurstof voor detectie van eiwitten in gel met minimale interferentie in daaropvolgende massaspectrometrie-analyse. proteoom. 2000;1(1):1–14. doi:10.1007/s102160000002

44. Rappsilber J, Ishihama Y, Mann M. Stop-and-go-extractietips voor matrix-ondersteunde laserdesorptie / ionisatie, nano-elektrospray en LC / MS-monstervoorbehandeling in proteomics. Anale Chem. 2003;75(3):663-670. doi:10.1021/ac026117i

45. Staufenbiel S, Merino M, Li W, et al. Oppervlaktekarakterisering en eiwitinteractie van een reeks model poly[acrylonitril-co-(N-vinylpyrrolidon)] nanocarriers voor medicijntargeting. Int. J. Pharm. 2015;485(1–2):87–96. doi:10.1016/j.ijpharm.2015.02.072

46. ​​​​Walkey-cd, Chan WC. De interactie van nanomaterialen met eiwitten in een fysiologische omgeving begrijpen en beheersen. Chem Soc Rev. 2012;41(7):2780-2799. doi:10.1039/c1cs15233e

47. Lammers T, Ulbrich K. HPMA-copolymeren: 30 jaar vooruitgang. Adv Drug Deliv Rev. 2010;62(2):119-121. doi:10.1016/j.addr.2009.12.004

48. Salvati A, Nelissen I, Haase A, et al. Kwantitatieve meting van de opname van nanodeeltjes door flowcytometrie geïllustreerd door een interlaboratoriumvergelijking van de opname van gelabelde polystyreen nanodeeltjes. Nano-impact. 2018;9:42-50. doi:10.1016/j.impact.2017.10.004

49. Lee K, Yu Y. Verstoring van de lipidedubbellaag veroorzaakt door amfifiele Janus-nanodeeltjes: het niet-monotone effect van geladen lipiden. Zachte materie. 2019. doi:10.1039/C8SM02525H

50. Jones MC, Jones SA, Riffo-Vasquez Y, et al. Kwantitatieve beoordeling van de hydrofobiciteit van nanodeeltjes aan het oppervlak en de invloed ervan op de biocompatibiliteit van de longen. J Bedieningsvrijgave. 2014; 183: 94-104. doi:10.1016/j.jconrel.2014.03.022

51. Li Y, Chen X, Gu N. Computationeel onderzoek naar interactie tussen nanodeeltjes en membranen: hydrofoob / hydrofiel effect. J Phys Chem B. 2008;112(51):16647-16653. doi:10.1021/jp8051906

52. Ong KJ, MacCormack TJ, Clark RJ, et al. Wijdverbreide interferentie van nanodeeltjesanalyse: implicaties voor nanotoxiciteitstesten. PLOS Een. 2014;9(3):e90650. doi:10.1371/journal.pone.0090650

53. Walczyk D, Bombelli FB, Monopoli MP, Lynch I, Dawson KA. Wat de cel "ziet" in de bionanowetenschap. J Am Chem Soc. 2010;132(16):5761–5768. doi:10.1021/ja910675v

54. Gunawan C, Lim M, Marquis CP, Amal R. Nanodeeltjes-eiwit corona-complexen bepalen het biologische lot en de functies van nanodeeltjes. J Mater Chem B. 2014;2(15):2060-2083. doi:10.1039/c3tb21526a

55. Jo DH, Kim JH, Lee TG, Kim JH. Grootte, oppervlaktelading en vorm bepalen de therapeutische effecten van nanodeeltjes op hersen- en netvliesaandoeningen. Nanogeneeskunde. 2015;11(7):1603–1611. doi:10.1016/j.nano.2015.04.015

56. Corbo C, Molinaro R, Parodi A, Toledano Furman NE, Salvatore F, Tasciotti E. De impact van nanodeeltjes-eiwitcorona op cytotoxiciteit, immunotoxiciteit en doelgeneesmiddelafgifte. Nanogeneeskunde (Londen). 2016;11(1):81-100. doi:10.2217/nnm.15.188

57. Dobrovolskaia MA, Aggarwal P, Hall JB, McNeil SE. Preklinische studies om de interactie van nanodeeltjes met het immuunsysteem en de mogelijke effecten op de biodistributie van nanodeeltjes te begrijpen. Mol Farm. 2008;5(4):487-495. doi:10.1021/mp800032f

58. Du Clos TW. Pentaxins: structuur, functie en rol bij ontstekingen. ISRN Ontsteking. 2013;2013:379040. doi: 10.1155/2013/379040

59. Roversi P, Johnson S, Caesar JJ, et al. Structurele basis voor complementfactor I-controle en de ziekte-geassocieerde sequentiepolymorfismen. Proc Natl Acad Sci VS A. 2011;108(31)::12839–12844. doi:10.1073/pnas.1102167108

60. Schwaeble WJ, Ali YM, Sim RB. Hoofdstuk 15 - de rollen en bijdragen van het complementsysteem in de pathofysiologie van auto-immuunziekten A2 - rose, noel R. In: Mackay IR, redacteur. De auto-immuunziekten. 5e druk. Boston: academische pers; 2014: 217-227.

Dit werk is gepubliceerd en gelicentieerd door Dove Medical Press Limited. De volledige voorwaarden van deze licentie zijn beschikbaar op https://www.dovepress.com/terms.php en bevatten de Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported, v3.0) License. Door toegang te krijgen tot het werk accepteert u hierbij de Voorwaarden. Niet-commercieel gebruik van het werk is toegestaan ​​zonder verdere toestemming van Dove Medical Press Limited, op voorwaarde dat het werk correct wordt toegeschreven. Voor toestemming voor commercieel gebruik van dit werk, zie paragraaf 4.2 en 5 van onze Voorwaarden.

Neem contact met ons op • Privacybeleid • Verenigingen & Partners • Getuigenissen • Algemene voorwaarden • Beveel deze site aan • Top

Neem contact met ons op • Privacybeleid

© Copyright 2021 • Dove Press Ltd • softwareontwikkeling door maffey.com • Webdesign door Adhesion

De meningen in alle hier gepubliceerde artikelen zijn die van de specifieke auteur(s) en weerspiegelen niet noodzakelijk de mening van Dove Medical Press Ltd of een van haar medewerkers.

Dove Medical Press maakt deel uit van Taylor & Francis Group, de Academic Publishing Division van Informa PLC Copyright 2017 Informa PLC. Alle rechten voorbehouden. Deze site is eigendom van en wordt beheerd door Informa PLC (“Informa”) met statutaire zetel 5 Howick Place, Londen SW1P 1WG. Geregistreerd in Engeland en Wales. Nummer 3099067. UK VAT Group: GB 365 4626 36

Om bezoekers van onze website en geregistreerde gebruikers een service te bieden die is afgestemd op hun individuele voorkeuren, gebruiken we cookies om bezoekersverkeer te analyseren en inhoud te personaliseren. U kunt meer te weten komen over ons gebruik van cookies door ons privacybeleid te lezen. We bewaren ook gegevens met betrekking tot onze bezoekers en geregistreerde gebruikers voor interne doeleinden en voor het delen van informatie met onze zakelijke partners. U kunt meer te weten komen over welke gegevens we van u bewaren, hoe deze worden verwerkt, met wie deze worden gedeeld en uw recht om uw gegevens te laten verwijderen door ons Privacybeleid te lezen.

Als u akkoord gaat met ons gebruik van cookies en de inhoud van ons privacybeleid, klikt u op 'accepteren'.